فلوسايتومتري
فلوسايتومتری
فلوسايتومتري روش دستگاهي بسيار سريع و قدرتمندي است كه براي شناسايي ذرات (سلول‌ها) و ارزيابي خصوصيّات آنها به كار مي‌رود. ذرات مورد آزمايش به صورت معلق در مايع با سرعتي حدود 5 تا 50 متر در ثانيه از ميان منفذي باريك و از مقابل پرتوي باريك از نور ليزر عبور مي‌كنند.
بدين ترتيب امكان جمع‌آوري اطلاعات مربوط به 5000 تا 50000 سلول در هر ثانيه فراهم مي‌شود. سلول‌ها از اجزاء مختلفي مثل غشاء سيتوپلاسمي، غشاء هسته‌اي، هسته و سيتوپلاسم تشكيل مي‌شود و تقريبا همه مولكول‌هاي موجود در قسمت‌هاي مختلف سلول را مي‌توان با استفاده از فلوسايتومتري رديابي و تعيين مقدار نمود. معمولاً مولكول‌هاي سطحي موجود در غشاء سيتوپلاسمي به راحتي در دسترس آنتي‌بادي قرار مي‌گيرند ولي براي رسيدن آنتي‌بادي يا ماده فلورسانس به مولكول‌هاي دروني سلول روش‌هاي مطمئن و موثري لازم است.
هر سلولي بر حسب نوع و تخصصي كه بر عهده دارد مولكول‌هاي مختص به خود را بيان مي‌كند، بدين معني كه همة ژن‌ها در همه سلول‌ها بيان نمي‌شوند بلكه برحسب وظيفه‌اي كه در طي تمايز بر عهده سلول گذاشته شده است و بر حسب محيطي كه در آن قرار مي‌گيرد هر سلولي خود انتخاب مي‌كند كه در پاسخ به شرايط محيطي كدام ژن را فعال سازد. بنابر اين رديابي پروتئين‌هاي سلولي حاصل از بيان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول مي‌تواند وسيله‌اي بسيار مفيد براي شناسايي سلول باشد. مولكول‌هاي سطحي سلول‌ها تحت نام عمومي CD كه مخفف Cluster Differentiation مي‌باشد شناخته مي‌شوند و براي رديابي آنها از آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال كونژوگه با فلوروكروم استفاده مي‌شود. برای مثال ماركرهاي سطحي سلولهاي NK عبارتند از CD16 و CD56 كه آنتي‌بادي‌هايي با همين نام قادرند اين مولكول‌ها را در سطح سلول شناسايي نمايند.
با استفاده از فلوسايتومتري محصولات پروتئيني ژن‌ها در داخل سلول نيز قابل رديابي هستند و نامگذاري آنتي‌بادي‌هاي مورد استفاده براساس نام پروتئين مورد نظر صورت مي‌گيرد. مثلاً پروتئين Zap-70 ساروگيت ماركر براي موتاسيون‌هاي ناحيه متغير زنجيره سنگين ايمونوگلوبولين مي‌باشد و در تعيين زير گروه‌هاي CLL اهميت دارد و توسط آنتي بادي با همين نام قابل شناسايي است.
آپوپتوز يكي از شكل‌هاي مرگ سلول مي‌باشد كه از نظر بيولوژي اهميت زيادي دارد و به همين دليل رديابي و اندازه‌گيري آپوپتوز در تحقيقات و موارد باليني اهميت پيدا مي‌كند. سلولهاي در حال آپوپتوز نشانه‌هاي زيادي دارند كه قابل اندازه‌گيري با فلوسايتومتري مي‌باشند اين نشانه‌ها عبارتند از تغييرات در غشا پلاسمائي سلول، تغييرات در نفوذپذيري غشاء پلاسمائي، تغييرات در نفوذپذيري غشاء ميتوكندري، فعال‌سازي كاسپازها و شكستگي‌هاي DNA سلولي.
شناسايي هر يك از اين تغييرات به تنهايي يا تركيبي از آنها به وسيلة فلوسايتومتري، امكان شناسايي و اندازه‌گيري سلولهاي آپوپتوتيك را از ميان مخلوطي از سلولهاي ديگر فراهم مي‌كند همچنين اطلاعات با ارزشي در بارة مسير مولكولي مرگ سلول‌ها به دست مي‌آيد. يشترين مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزيابي آنتی‌ژن‌هاي سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها مي‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌هاي مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. روش جداسازي سلول‌ها با استفاده از خصوصيات فلورسانس آنها توسط ايمونولوژيست‌هايي ابداع شد كه تلاش مي‌كردند جمعيت‌هاي خالص سلول‌ها را از نمونه‌هاي مختلط تهيه كرده و پس از تكثير آنها در محيط كشت سلولي، نقش مجزاي هر سلول را در سيستم ايمني بررسي نمايند.
|
نمونه |
اختلال مورد بررسي |
CD Markers |
|
|
خون محيطي |
مغز استخوان |
||
|
√ |
- |
Immunodeficiency disorders |
CD2, CD3, CD4, CD8, CD7, CD19, CD20 |
|
√ |
√ |
Myeloproliferativedisorders (AML, M0,M7,CML,CMML) |
CD13, CD33, CD11c, CD14, CD16, CD34, HLA-DR |
|
√ |
√ |
B-Cell Lymphoproliferative disorders (ALL, CLL, HCL, MCL) |
CD10,CD19, CD20,CD22, CD23,CD34 |
|
√ |
√ |
T-Cell Lymphoproliferative disorders (T-PLL, PTCL, ATLI, L
|
CD2,CD3,CD4,CD5,CD7, CD8 |
|
√ |
√ |
Platelet disorder (ITP) |
CD41,CD61 |
|
√ |
√ |
Plasma cellmyeloma (MM) |
CD38, CD138 |