زمان نمونه‌گیری: کورتیزول دارای ریتم روزانه است و به همین دلیل معمولاً نمونه‌گیری صبحگاهی (بین ساعت 7 تا 9 صبح) توصیه می‌شود.
ناشتا بودن: ناشتایی الزامی نیست.
استراحت قبل از آزمایش: بیمار باید از فعالیت بدنی سنگین، استرس و اضطراب قبل از انجام آزمایش پرهیز کند، زیرا این عوامل می‌توانند بر سطح کورتیزول موثر باشند.
توقف داروها: داروهای استروئیدی و کورتیکواستروئیدها ممکن است بر نتایج آزمایش تأثیر بگذارند، بنابراین درصورت مصرف این داروها آزمایشگاه را مطلع سازید.
مصرف کافئین: بهتر است قبل از آزمایش مصرف کافئین (چای، قهوه) محدود شود، زیرا کافئین ممکن است روی نتایج تأثیر بگذارد.
مصرف الکل: از مصرف الکل حداقل 24 ساعت قبل از انجام آزمایش خودداری شود.
زمان خواب و بیداری: شب قبل از آزمایش به موقع بخوابد و استراحت کافی داشته باشید.