زمان نمونه‌گیری: ACTH نیز مانند کورتیزول دارای یک ریتم روزانه است. به همین دلیل معمولاً توصیه می‌شود که نمونه‌گیری صبح زود، در فاصله زمانی بین 7 تا 9 صبح انجام شود
ناشتا بودن: ترجیحا 8 ساعت ناشتایی توصیه می شود. مصرف آب بدون محدودیت مجاز است.
استرس و فعالیت بدنی: استرس و ورزش شدید می‌توانند بر سطح ACTH موثر باشند. به همین دلیل بیمار باید قبل از آزمایش در وضعیت استراحت و آرامش باشد.
مصرف دارو: برخی داروها مانند کورتیکواستروئیدها و ضدافسردگی‌ها می‌توانند سطح ACTH را تغییر دهند. درصورت مصرف این داروها آزمایشگاه را مطلع سازید
مصرف الکل و نیکوتین: بیمار باید از مصرف الکل و نیکوتین حداقل 24 ساعت قبل از آزمایش خودداری کند، زیرا این مواد می‌توانند بر سطح ACTH تأثیر بگذارند.
خواب و بیداری: خواب ناکافی و نامنظم می‌تواند سطح ACTH را تحت تأثیر قرار دهد، بنابراین توصیه می‌شود بیمار شب قبل از آزمایش به موقع بخوابد.
آمادگی ذهنی: بهتر است بیمار از هرگونه شرایط استرس‌زا یا اضطراب قبل از آزمایش دوری کند، زیرا استرس می تواند بر سطح ACTH تاثیر گذار باشد.